1、适用范围 水质（粪）大肠菌群的测定 纸片快速法

    本标准适用于地表水、生活污水、医疗机构及禽畜养殖业等其他行业排放的废水中（粪）大肠菌群的快速筛查。

    本方法的检出限为20MPN/L。

 2、规范性引用文件

     本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。HJ/T91地表水和污水监测技术规范

 3、术语和定义

     下列术语和定义适用于本标准。

 3.1总大肠菌群（total coliforms）

     在37℃培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

 3.2 粪大肠菌群（fecal coliforms）

     44.5℃培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的总大肠菌群，属粪性来源，称为粪大肠菌群。

 4、方法原理

     将一定量的乳糖、指示剂（溴甲酚紫和2，3, 5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及营养成分等吸附于一定面积的无菌滤纸上，当细菌生长繁殖时，产酸使PH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色。同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的PH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有（粪）大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应（粪）大肠菌群的浓度值。

 5、试剂和材料

     除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂。

 5.1市售水质总大肠菌群、粪大肠菌群测试片：10ml水样量纸片按附录A的方法进行质量鉴定，达到要求后方可使用。

 5.2无菌水

     用新制备的去离子水或蒸馏水，按无菌操作要求，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

 5.3硫代硫酸钠溶液：ρ(Na₂S₂O₃)=0.10g/mL

    称取硫代硫酸钠10g，溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100mL，现配。

 5.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na₂）溶液：ρ(C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂· 2H₂O)=0.15g/mL

    称取EDTA-Na₂ 15g,溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100mL，此溶液保质期为30d。

 6、仪器和设备

6.1 恒温培养箱：37℃±1℃。

6.2 恒温培养箱：44℃±0.5℃。

6.3 高压蒸汽灭菌器：121℃、101.3kpa。

6.4 冰箱：0-4℃

6.5 移液管：1±0.01mL、10±0.1mL。

6.6 试管：φ15mm×150mm。

6.7 采样瓶：500mL。

注1：移液器、试管、采样瓶等玻璃器皿实验前要按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌20min，烘干，备用。

7、样品

    用灭菌器具，按照HJ/T 91的规定及无菌操作的要求，采集水样400mL放入已灭菌的采样瓶中。如果是经加氯处理的废水，需在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na₂）溶液（5.4）1.2mL，以消除干扰。酸性样品，需调节PH值至7.0-8.0。

    采样后2h内检测，否则，需10℃以下冷藏并6h内送检，实验室接样后，应将样品放入0-4℃冰箱并2h内测定。

注2:10mg硫代硫酸钠可保证去除水样中1.5mg余氯，硫代硫酸钠用量可根据水样实际余氯量调整。

8、分析步骤

8.1接种量

    每个样品按三个不同的接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15张纸片。

根据水样的污染程度确定接种量，应尽可能使5个接种量最大的纸片为阳性、5个接种量最小的纸片为阴性。

清洁水样的参考接种量分别为10 mL、1 mL、0.1 mL，受污染水样参考接种量根据污染程度可接种1 mL、0.1mL、0.01 mL或0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL等。

    接种量小于1mL时，水样应制成稀释样品后使用。接种量为0.1mL、0.01 mL时，分别制成1:10稀释样品、1:100稀释样品。其它接种量的稀释样品依次类推。

    1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL水样，注入盛有9 mL无菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。其它稀释度的稀释样品同法制作。

8.2接种、培养

    水样充分混匀，按无菌操作制作稀释水样及接种水样。

    清洁水样，接种水样总量为55.5mL，10 mL水样量纸片5张，每张接种水样10mL，1 mL水样量纸片10张，其中5张各接种水样1mL，另5张各接种1:10的稀释水样1mL。受污染水样，接种3个不同稀释度的1mL稀释水样各5张。

    接种水样应均匀涂布于纸片上，纸片充分侵润、吸收水样，用手轻轻压平，做好标记。

    测总大肠菌群时，在37±1℃的条件下培养18-24h后观察结果；测粪大肠菌群时，在44.5±0.5℃的条件下培养18-24h后观察结果。

注3：

    1）检测粪大肠菌群时，纸片接种后应立即放置于44.5±0.5℃的恒温培养箱中培养，在常温下放置过久将影响检测结果的准确性。

2）纸片加入水样后，短时间内变黄或退色，表明水样存在酸性物质活氧化剂干扰，需按“7样品”一节方法去除相应干扰。

8.3结果判定

（1）纸片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。

（2）纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。

（3）纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。

（4）纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄，为阴性。

（5）纸片无变化，为阴性。

9结果计算与表示

9.1  结果计算

根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表（附录A），经下面的公式换算报告1L 水中（粪）大肠菌群数：

9.2  结果表示

测定结果保留二位有效数字，大于100时以科学计数法表示，结果的单位为MPN/L。平均值以几何平均计算。

10  废弃处理

使用后的器皿及废弃物须经121℃高压蒸汽灭菌20min后，器皿方可清洗，废弃物作为普通垃圾处理。